@misc{oai:niigata-u.repo.nii.ac.jp:00005005,
 author = {谷川, 太一朗},
 month = {Mar},
 note = {Serratia marcescensは化学的に異なる二つの菌体外脂質(赤色色素であるprodigiosin及びバイオサーファクタントであるserrawettin W1)の産生が温度によって同時に調節される菌として知られている。このような温度依存性を掌る機構を遺伝学的に調べていたところ、これらの菌体外脂質を多量に産生するトランスポゾン(mini-Tn5)挿入変異株Tan1が分離された。Tan1株のトランスポゾンが挿入されたDNA領域をクローニングし、シーケンス分析を行った結果、トランスポゾンが挿入された位置には945bpから成るopen reading frameが存在することが判明した。その後、この遺伝子をhexSと名付けた。ORFから導き出した推定314アミノ酸配列のhomology分析により、このタンパク質はErwinia carotovora ssp. carotovoraのLysR-type transcriptional regulator HexAと高い相同性を持つことが示された。Cassette mutagenesisにより取得した変異株1S(hexS::Cm^r)は、Tan1株と同様にprodigiosin及びserrawettin W1を多量に産生した。RT-PCR分析により、274株に比べTan1株は、pigA遺伝子(prodigiosin合成に必要なpig clusterの一番目の遺伝子)、swrW遺伝子(nonribosomal peptide synthetase familyに属するserrawettin W1 synthetaseをコードする遺伝子)の転写量が多いことが判った。一方、pswP遺伝子(phosphopantetheinyl transferaseをコードする遺伝子)の転写量は、274株との間に違いはみられなかった。更に、pHEX29 (hexS gene carrier)で形質転換したTan1株のRT-PCR分析により、Tan1株にみられたpigA及びswrW遺伝子のmRNAの多量産生は、hexS DNAで形質転換することによって抑えられた。一方、pswP遺伝子の転写量は、pHEX29で形質転換した株とpSTV29 (control plasmid)で形質転換した株との間に違いはみられなかった。His_6-HexSタンパク質とpigA遺伝子、swrW遺伝子、pswP遺伝子上流領域との結合性をgel mobility shift分析により調べたところ、HexSタンパク質は、pigA及びswrW遺伝子上流領域への結合活性を示した。一方、pswP遺伝子上流領域への活性は示さなかった。そして、HexSタンパク質の結合箇所を特定するためにDNase footprinting分析を行ったところ、HexSタンパク質の結合箇所がpigA及びswrW遺伝子上流領域共に多数存在することが判った。Low-copy plasmidであるpHEX29で274株を形質転換させたところ、この形質転換体は菌体外脂質であるprodigiosin及びserrawettin W1産生が強く抑制され、また菌体外酵素に関しては、phospholipase Cを除いたprotease、chitinase、DNaseの酵素活性が減少した。以上のことから、HexSはpig遺伝子クラスター及びswrW遺伝子に対しtranscriptional negative regulatorとして働いていることが証明された。そして、S. marcescensおいてHexSはglobal negative regulatorとしての機能を持つことが示唆された。, Serratia marcescens has been known as a temperature-dependent producer of two chemically different exolipids (red pigment prodigiosin and biosurfactant serrawettin W1) in parallel. During genetic investigation of such control mechanisms, transposon (mini-Tn5) insertional mutant Tan1 overproducing these exolipids was isolated. By cloning and sequencing of transposon-inserted DNA region in Tan1, the presence of a distinct open reading frame (ORF, 945 bp) was indicated, and this gene was named hexS. Homology analysis of the presumed product with 314 amino-acids demonstrated remarkable similarity between the product HexS and LysR-type transcriptional regulator HexA of Erwinia carotovora ssp. carotovora. The mutant 1S (hexS::Cm^r) obtained by cassette mutagenesis showed the same phenotype as Tan1, i.e. overproduction of prodigiosin and serrawettin W1. By RT-PCR analysis, the hexS mutant was shown to over-transcript the pigA gene (first gene of pig cluster involved in prodigiosin synthesis) and swrW gene encoding serrawettin W1 synthetase belonging to nonribosomal peptide synthetase family. In contrast, transcription of pswP gene encoding phosphopantetheinyl transferase in Tan1 was in the level of parent strain 274. Furthermore, by RT-PCR analysis of Tan1 transformed with pFIEX29 (hexS gene carrier), the transformant with hexS DNA was shown to suppress over-transcription of pigA and swrW in Tan1. In contrast, the transcription level of pswP showed no differences between the transformant with pSTV29 (control plasmid) and that with pHEX29. By gel mobility shift analysis using purified His_6-HexS protein and pigA, swrW, and pswP DNA fragments, the HexS protein showed binding activity to DNA fragments of the upstream region of pigA and swrW genes and not to that of pswP gene. Furthermore, DNase footprinting analysis to identify HexS-binding sites at the upstream regions of pigA and swrW genes demonstrated the presence of many HexS-binding sites in the upstream regions of these genes. S. marcescens strain 274 transformed with low-copy plasmid carrying hexS demonstrated reduced production of prodigiosin and serrawettin W1, and reduced activity of exoenzymes (protease, chitinase, and DNase) except phospholipase C. Thus, this study demonstrated that HexS can act as a transcriptional repressor for pig cluster and swrW, and that gene regulation by HexS may work globally in S. marcescens., 新潟大学大学院自然科学研究科, 平成19年3月22日, 新大院博（農）甲第71号, 新大院博（農）甲第71号},
 title = {Serratia marcescensのprodigiosin及びserrawettin W1生合成を調節するHexSに関する研究},
 year = {2007}
}