@misc{oai:niigata-u.repo.nii.ac.jp:00004718,
 author = {Mori, Shiro},
 month = {Mar},
 note = {In the present study, the following experiments were carried out in order to apply molecular breeding for flower color modification to Liliaceous ornamentals. 1. Establishment of genetic transformation systems As a first step toward the establishment of genetic transformation systems, development of fast growing and highly regenerable callus cultures was examined, since such cultures may be most suitable as a target material for transformation in Liliaceous ornamentals. Firstly, callus induction from cultured explants and plant regeneration from induced calluses were examined in 19 Muscari species and cultivars. Embryogenic callus cultures were induced on a medium containing 54 μM NAA from leaf and/or flower bud explants of six species and cultivars. Following transfer to PGR-free medium, the embryogenic calluses produced somatic embryos, which subsequently developed into plantlets. Secondly, callus induction and plant regeneration were examined in 33 Lilium species and cultivars. Organogenic callus cultures were induced on a medium containing 4.1 μM PIC from seed, bulb-scale, leaf and/or filament explants of 30 species and cultivars. Following transfer to media lacking PGRs or containing 22 μM BA, the organogenic calluses produced shoots, which subsequently developed into plantlets. Development of an Agrobacterium-mediated transformation system of Tricyrtis hirta was examined by utilizing previously induced embryogenic callus cultures. The calluses were co-cultivated with A. tumefaciens strain EHA101/pIG121Hm for 7 days in the presence of AS, and then transferred onto a hygromycin-containing selection medium. After 8 weeks Hygr somatic embryos were produced from the co-cultivated calluses, and these somatic embryos subsequently developed into plantlets. PCR analysis and GUS histochemical assay confirmed the transgenic nature of the regenerated plantlets. On average, about ten independent transgenic T. hirta plants could be obtained per 1g FW of co-cultivated embryogenic calluses by using this transformation system. For perennial and vegetatively propagated crops including almost all the Liliaceous ornamentals, long-term and stable expression of transgene(s) is one of the indispensable requisites for their improvement by genetic transformation. Therefore, firstly, morphological characterization and examination of the ploidy level and transgene (GUS gene) expression were carried out in transgenic plants of Agapanthus praecox ssp. orientalis following 5 years of cultivation in pots. Although polyploidization and morphological variations were observed in some transgenic plants, all the transgenic plants showed stable expression of the transgene. Secondly, transgene (GUS gene) expression was examined in transgenic T. hirta plants following 2 years of cultivation in pots. Stable expression of the transgene was observed in all the transgenic plants examined., No apparent transgene silencing was observed in these two Liliaceous ornamentals. 2. Biochemical and molecular biological information on the flavonoid biosynthetic pathway In order to perform molecular breeding for flower color modification systematically, anthocyanin and/or anthocyanin analyses were carried out in flower organs of 13 Muscari species and cultivars, four Agapanthus cultivars, and two Tricyrtis species. For Muscari spp. and Agapanthus spp., blue or pale blue flower organs mainly contained delphinidin, whereas dark brown or reddish purple flower organs mainly contained cyanidin. Pelargonidin was never detected in flower organs of Agapanthus spp. and Muscari spp. For two Tricyrtis spp., the same six anthocyanins, all cyanidin derivatives, were detected in tepals. Isolation and characterization of genes for the flavonoid biosynthetic pathway were examined in several plant species. Firstly, the F3'5'H gene (VmFH1) was isolated from the Apocynaceous species Vinca major. VmFH1 contained an ORF of 1,518 bp, encoding a polypeptide of 506 amino acid residues, and the percentage identities of the deduced amino acid sequence of VmFH1 to the previously reported F3'5'H genes were 51-83%. Heterologous expression of VmFH1 under the control of the CaMV35S promoter in transgenic expression of VmFH1 under the control of the CaMV35S promoter in transgenic Petunia hybrida resulted in drastic flower color alteration from red to deep red with deep purple sectors. These transgenic plants accumulated delphinidin, petunidin and malvidin in their petals, which were never detected in non-transgenic plants. Secondly, the DFR gene (ApDFR1) was isolated from Agapanthus praecox ssp. orientalis. ApDFR1 contained an ORF of 1,137 bp, encoding a polypeptide of 379 amino acid residues, and the percentage identities of the deduced amino acid sequence of ApDFR1 to the previously reported DFR genes were 59-75%. Thirdly, isolation of the F3'5'H from Muscari armeniacum was examined. The isolated cytochrome P450 gene (MaP450) contained an ORF of 1,512 bp, encoding a polypeptide of 504 amino acid residues. Although the deduced amino acid sequence of MaP450 showed only low identities (34-37%) to that of the previously reported F3'5'H genes, a close correlation between MaP450 expression and anthocyanidin accumulation as well as flower color indicates that this gene may be involved in the flavonoid biosynthetic pathway in Muscari armeniacum. 3. Attempts at flower color modification by genetic transformation In order to modify flower color by genetic transformation, Tricyrtis hirta and Muscari armeniacum were transformed with gene(s) for flavonoid biosynthetic pathway. Firstly, the F3'5'H gene from Vinca major (VmFH1) and/or the DFR gene from Agapanthus praecox ssp. orientalis (ApDFR1), both under the control of the CaMV35S promoter, were introduced into T. hirta. However, no apparent alterations in flower color and anthocyanin composition in tepals were observed in eight independent transgenic plants containing VmFH1, three independent transgenic plants containing ApDFR1 and one transgenic plant containing both VmFH1 and ApDFR1. Secondly, VmFH1 under the control of VmFH1 original promoter was introduced into M. armeniacum. Two independent transgenic plants have so far been produced. Analyses of anthocyanidins and anthocyanins in flower organs should be carried out on these transgenic plants when they produced flowers., 本研究では,花色改変分子育種をユリ科花き園芸植物に応用することを目的として,以下のような実験を行った。, 1.形質転換システムの確立 効率的な形質転換システムを確立するための前段階として,形質転換の材料となりうる,高い植物体再生能力を保持したカルス培養系の確立について検討した.まず,19種・品種のムスカリ属植物(Muscari spp.)を供試してカルス培養系の確立を試みたところ,54μM NAAを含む培地上で,6種・品種の葉または花蕾外植体からエンブリオジェニックカルスを誘導することができた.これらのエンブリオジェニックカルスを植物成長調節物質無添加の培地に移植したところ,不定胚を経由して小植物体が再生した.次に,33種・品種のユリ属植物(Lilium spp.)を供試してカルス培養系の確立を試みたところ,4.1μM PICを含む培地上で,30種・品種の種子,鱗片,葉または花糸外植体から器官形成能力を保持したカルスを誘導することができた.これらのカルスを植物生長調節物質無添加または22μM BAを含む培地に移植したところ,小植物体が再生した.すでに誘導されているホトトギス(Tricyrtis hirta)のエンブリオジェニックカルスを用いて,アグロバクテリウム法による形質転換システムの確立を検討した.エンブリオジェニックカルスをAgrobacterium tumefaciens EHA101/pIG121Hm系統とAS存在下で7日間共存培養した後,ハイグロマイシンを含む選抜培地に移植した.その結果,8週間後にはハイグロマイシン耐性の不定胚が形成され,それらは小植物体に発達した.PCR分析および組織化学的GUS分析により,再生植物体が形質転換体であることが確認された.この形質転換システムにより,1g新鮮重のエンブリオジェニックカルスから,平均で10系統の形質転換体を得ることができた.多くのユリ科花き園芸植物のように多年生で栄養繁殖性の植物では,形質転換体における外来遺伝子の長期的・安定的な発現が求められる.そこで,まず,5年間栽培したアガパンサス(Agapanthus praecox ssp. orientalis)形質転換体において,倍数性,形態,および外来遺伝子であるGUS遺伝子の発現等を調査した.その結果,染色体加倍や形態変異は観察されたものの,調査した全ての形質転換体において外来遺伝子の長期的かつ安定的な発現が示された.次に,2年間栽培したホトトギスの形質転換体において,外来遺伝子であるGUS遺伝子の発現を調査したところ,調査した全ての形質転換体においてGUS遺伝子の安定的な発現が示された.アガパンサスおよびホトトギスの形質転換体においては,外来遺伝子の明らかなジーンサイレンシングはみられなかった., 2.フラボノイド生合成経路に関する生化学的・分子生物学的調査花色改変分子育種を効率的に行うことを目的として,13種・品種のムスカリ属植物(Muscari spp/.),4品種のアガパンサス属植物(Agapanthus spp.)および2種のホトトギス属植物(Tricyrtis spp.)を供試し,花器官におけるアントシアニンおよびアントシアニジン分析を行った.その結果,ムスカリ属およびアガパンサス属植物では,青色または淡青色の器官における主要なアントシアニジンはデルフィニジンであり,褐色および赤紫色の花器官における主要なアントシアニジンはシアニジンであった.なお,ムスカリ属およびアガパンサス属植物の花器官においては,ペラルゴニジンは検出されなかった.一方,2種のホトトギス属植物の花被においては,ともにシアニジン系計の6種類のアントシアニンが検出された.花色改変分子育種を行う上で必要とされる,フラボノイド生合成経路に関連する遺伝子の単離および特徴づけを行った.まず,キョウチクトウ科のツルニチニチソウ(Vinca major)からF3'5'H遺伝子(VmFH1)を単離した.VmFH1のORF領域は1.518bpであり,506アミノ酸をコードしていると推定された.VmFH1と既知のF3'5'H遺伝子との推定アミノ酸配列の相同性は83-51%であった.VmFH1をペチュニア(Petunia hybrida)の形質転換体で発現させたところ,花色は赤色から濃紫色の領域を伴った農赤色へ変化し,花弁において新たにデルフィニジン,ペチュニジンおよびマルビジンが検出された.次に,アガパンサス(Agapanthus praecox ssp. orientalis)からDFR遺伝子(ApDFR1)を単離した.ApDFR1のORF領域は1.137bpであり,379アミノ酸をコードしていると推定された.ApDFR1との既知のDFR遺伝子との推定アミノ酸配列の相同性は75-59%であった.さらに,ムスカリ(Muscari armeniacum) からF3'5'H遺伝子の単離を試みたところ,得られた遺伝子(MaP450)のORF領域は1.512bpであり,504アミノ酸をコードしていると推定された.MaP450と既知のF3'5'H遺伝子との推定アミノ酸配列の相同性は低かった(37-34%),しかし,MaP450の発現とアントシアニジンの蓄積に相関がみられたことから,MaP450はムスカリにおけるフラボノイド生合成経路に関与した遺伝子であると予想された.3.形質転換による花色改変の試み形質転換による花色の改変を目的として,形質転換システムが確立しているホトトギス(Tricyrtis hirta)およびムスカリ(Muscari armeniacum)にフラボノイド生合成経路関連遺伝子を導入した.まず,CaMV35Sプロモーター制御下のツルニチニチソウ(Vinca major)由来F3'5'H遺伝子(VmFH1)およびアガパンサス(Agapanthus praecox ssp. orientalis)由来DFR遺伝子(ApDFR1)をホトトギスに導入した.VmFH1が導入された8系統の形質転換体,ApDFR1が導入された3系統の形質転換体,およびVmFH1およびApDFR1が導入された1系統の形質転換体について形質調査を行ったところ,いずれの形質転換体においても明らかな花色の変化はみられず,また,花被のアントシアニン分析においても質的な変化はみられなかった.次にVmFH1オリジナルプロモーター制御下のVmFH1をムスカリに導入した.これまで2系統の形質転換体が得られている.今後,これらの形質転換体の開花を待って,色素分析を含む形質調査を行う必要がある., 新大院博（学）甲第170号, 新大院博（学）甲第170号},
 title = {Fundamental studies on the molecular breeding for flower color modification in Liliaceous ornamentals},
 year = {2006}
}