@article{oai:niigata-u.repo.nii.ac.jp:00028421, author = {Takahashi, Hideyuki and Ishikawa, Toshiki and Hayakawa, Tohru and Itoh, Kimiko and Mitsui, Toshiaki and Hori, Hidetaka}, issue = {1}, journal = {新潟大学農学部研究報告, 新潟大学農学部研究報告}, month = {Aug}, note = {Our previous study using liquid organ cultured adventitious roots from turnip (Brassica rapa L.) showed that Ca2+ is required for induction of defense responses in the cultured roots on the treatment with Plasmodiophora brassicae resting spores (Takahashi et al., 2006). To evaluate change in [Ca2+]cyt in cultured root cells on contact with the spores, acetoxymethyl ester derivative of Fura-2 (Fura-2/AM) was loaded into the roots. When ionophore A23187 was treated with Ca2+ simultaneously, the Fura-2 fluorescence ratio that represents relative [Ca2+]cyt increased promptly, showing that the Fura-2/AM system is suitable to evaluate [Ca2+]cyt change in cultured root cells in a second range. Applicability of this method for studies on Ca2+ fluctuation against various extracellular stimuli was supported by observations that treatment with mannitol or NaCl also immediately increased the Fura-2 ratio. When the Fura-2/AM loaded roots were treated with resting spores, no [Ca2+]cyt change was observed during 500 second but when treated with spores pre-incubated with germination-enhancing suspension (GES), a slight but reproducible increase in [Ca2+]cyt was observed. We conclude that although further analysis is needed, the Fura-2/AM system will contribute to revealing the Ca2+ involvement in clubroot-resistance response. 我々は以前の研究において、カブ(Brassica rapa L.)幼根から誘導した培養根を用い、根こぶ病菌Plasmodiophora brassicaeに対する初期抵抗反応の誘導にCa2+ が必要であることを示した(Takahashi et al., 2006)。本研究では、根こぶ病抵抗反応におけるカブ培養根の細胞内Ca2+ 濃度([Ca2+]cyt)の変動を調査するため、Ca2+ の蛍光指示薬Fura-2のアセトキシメチルエステル(Fura-2/AM)をカブ培養根に導入し、蛍光顕微鏡により[Ca2+]cyt を定量的に解析することを試みた。蛍光顕微鏡下で細胞質内にFura-2が導入されたことが確認できたカブ培養根に、カルシウムイオノフォアA23187とCa2+ を同時に処理すると、直ちに[Ca2+]cyt の相対値を示すFura-2蛍光比が上昇したことから、Fura-2/AM を用いた本手法は、培養根における[Ca2+]cyt の変化を観察するのに適していることが示された。さらに[Ca2+]cyt を増加させることが知られている外的刺激として、マンニトール及びNaCl の高濃度処理を行ったところ、同様なFura-2蛍光比の急激な増加が観察され、本手法の汎用性が示された。次に、我々は本来の目的である根こぶ病抵抗反応における[Ca2+]cyt の解析に本手法を応用した。Fura-2/AM を導入した根こぶ病抵抗性カブ培養根にP. brassicae の休眠胞子を処理しても、500秒の測定時間内に[Ca2+]cyt が変化することは無かった。しかし休眠胞子を発芽促進液(GES: germination enhancing suspension)で前処理し、同様の実験を行ったところ、非常にわずかであったものの、再現性ある[Ca2+]cyt の上昇が観察された。根こぶ病に対する初期抵抗反応におけるCa2+ の重要性を立証するためには、今後さらなる解析が必要であるが、その過程において本手法は大きく貢献するものと期待される。}, pages = {61--66}, title = {Loading of Fura-2 into Liquid Organ Cultured Adventitious Root of Turnip (Brassica rapa L.) Resistant to Clubroot Pathogen Plasmodiophora brassicae and Determination of [Ca2+]cyt}, volume = {60}, year = {2007} }